线粒体代谢调控组织损伤修复不同阶段中巨噬细胞功能转换

组织结构和功能损伤修复是一个基本的生物学过程，是生命体生存所必需的。损伤修复分为两个阶段，促炎阶段（抗菌防御）和促修复阶段（组织生长和分化）。在这个过程中，参与损伤修复的MΦ（wound MΦ, 伤口MΦ）需要应对损伤组织的微环境并迅速调整状态来行使其功能。具体来说，损伤发生后，外周血单核细胞被招募到损伤部位，激活为1型MΦ，1型MΦ具有促炎和促血管生成特征，参与微生物抵御、促进组织血管化和受损组织的再生生长。在第二阶段，MΦ激活为2型，促进瘢痕形成和修复。然而，伤口MΦ从促炎1型到促修复2型转变的分子调控机制仍不清楚。

单核细胞/巨噬细胞（MΦ）是参与机体损伤修复的重要免疫细胞。一些研究（主要是体外研究）表明，在MΦ激活过程中伴随着细胞代谢重编程。理解这个重编程过程会为促进组织的修复、再生能力提供理论基础。然而，在组织损伤修复过程中不同阶段的MΦ的代谢重编程、信号调控、活化类型之间的关系仍不明确。

最新研究

2021年8月28日，来自科隆大学的Sabine A. Eming团队在Cell Metabolism 上发表了题为《Mitochondrial metabolism coordinates stage-specific repair processes in macrophages during wound healing》的文章，作者发现早期和晚期伤口MΦ在转录和代谢方面存在显著差异，早期MΦ不仅需要糖酵解功能，还依赖线粒体产生的活性氧的来稳定HIF-1α促进促炎症、促血管生长；晚期MΦ依赖于M2型信号-IL-4Ra受体-氧化磷酸化途径增强修复功能。该发现揭示了愈伤过程中巨噬细胞代谢重编程的机制与意义，提供了促进伤口MΦ功能的新靶点。

伤口MΦ在损伤早期和晚期呈现不同的代谢模式和基因表达模式

为了研究伤口MΦ（CD45+CD11b+F4/80+细胞）在整个损伤修复期间的代谢特征，作者使用了C57BL/6野生型小鼠背部全层切除皮肤损伤模型，从炎症早期（损伤后4天）和瘢痕形成晚期（损伤后14天）的创面组织中分离出MΦ。作者首先测定了细胞耗氧率（OCR）和基础细胞外酸化率（ECAR），发现与早期伤口MΦ相比，晚期伤口MΦ有更高的基础呼吸、ATP周转率和剩余呼吸能力，并且糖酵解程度明显较低。Mito-TrackerTM Green （MTG）荧光染色显示，晚期MΦ中有更多的线粒体，这与其较高的OCR一致。综上所述，早期和晚期的伤口MΦ能量代谢特征有显著差异，晚期MΦ较高的氧气消耗可能是由于线粒体重量增加和OXPHOS上调引起的。

那么代谢模式重编程是由转录组的重编程引起的吗？RNA-seq结果提示愈伤早期和晚期MΦ的基因表达谱有显著的差异，在早期MΦ中促炎相关基因（Nos2和Ptgs2）和促血管生成（Vegfa）基因高表达，在晚期MΦ中2型细胞因子相关基因 （Ccl22、Ear2 Irf4, Mgll, Mgl2, Mrc1和Retnla）高表达。

通路富集的结果与两种MΦ代谢模式也是一致的：早期MΦ表现出糖酵解/糖异生和HIF-1信号相关基因和通路的富集，和线粒体相关的代谢过程有血红素代谢、柠檬酸代谢和琥珀酸代谢；而晚期MΦ在2型细胞因子诱导的途径中富集，表现出更高的脂肪摄取和分解代谢，和线粒体相关的代谢过程有肉碱代谢、线粒体蛋白质翻译的tRNA氨基酰化、ATP运输和线粒体DNA复制。上述结果表明伤口MΦ在早期和晚期有不同的基因表达模式和代谢模式。

伤口MΦ的亚群异质性

为了进一步解析不同时期伤口MΦ中基因表达和代谢模式的异质性，作者对早期和晚期伤口MΦ进行了单细胞测序（scRNA-seq）分析。结果显示MΦ可以分为7个群。早期MΦ以2群和3群为主，而晚期MΦ以0群、1群和6群为主，这提示MΦ的细胞类型在伤口愈合的不同时期存在异质性。对各个群中早期、晚期伤口MΦ做特征评分发现，同一个群中早期MΦ细胞的M1和糖酵解特征评分更高，晚期MΦ细胞的M2和OXPHOS特征评分更高，这与RNA-seq的结果是一致的，表明伤口愈合过程中MΦ从M1/糖酵解型向M2氧化型MΦ转变。

损伤早期，线粒体呼吸链调控MΦ的促炎、促血管生成功能

线粒体呼吸链（MRC）在调控MΦ极化的代谢重编程中发挥重要作用。那么，在伤口愈合过程中MRC如何调节伤口MΦ的极化呢？

有研究报道，Dars2基因编码线粒体天冬氨酸-tRNA合成酶2，是调控线粒体内的呼吸链相关蛋白质合成的关键基因。作者通过条件性敲除Dars2构建了髓系细胞MRC失活的小鼠模型。作者用LPS+IFN-g处理骨髓来源的巨噬细胞（BMDM ）[M(LPS + IFN-g)]，发现LPS+IFN-g显著诱导了WT BMDM中促炎因子基因（Il1b, Il6和Tnfa）的表达，而在Dars2 KO 的BMDM中促炎因子变化不显著。此外，Retnla、Arg1和Chil3在用IL-4 + IL-13处理BMDM [M(IL-4 + IL-13)]诱导的WT BMDM中显著升高、在Dars2 KO BMDM中变化不显著。这些发现表明在体外Dars2调控BMDM的促炎、促修复表型极化。

那么，MRC失活会影响伤口MΦ的体内修复功能吗？作者发现，与WT 小鼠相比，Dars2 MKO 小鼠的MΦ中NDUFB8 （CI）的蛋白水平显著减少、UQCRC2 （CIII）和COX1 （CIV）的蛋白水平有一定程度的减少，这表明Dars2 KO MΦ确实发生了MRC缺陷。接下来，作者分析了Dars2 MKO小鼠的伤口愈合和组织恢复能力是否受到了影响。组织形态学分析显示，与对照组小鼠相比，Dars2 MKO小鼠的伤口闭合显著延迟，存在肉芽组织显著减少、结痂脱落延迟和早期创面血管化显著减少等特征，表明MRC失活会削弱伤口MΦ的体内修复功能。有趣的是，Dars2 MKO小鼠在第4天和14天时创面MΦ数量和WT小鼠相当。这表明MRC缺陷并未影响血液单核细胞招募到损伤部位。

那么MRC影响伤口MΦ功能的机制是什么？髓系细胞中HIF-1α介导表达的VEGFA是组织修复中促血管生成的关键细胞因子，前期RNA-seq结果提示VEGFA在早期MΦ中高表达。作者进一步发现早期Dars2 MKO小鼠的MΦ中HIF-1α靶基因水平表达显著降低（包括Vegfa、糖酵解和促炎基因），提示HIF-1α通路可能参与了MRC对MΦ功能的调控。

早期MΦ通过MRC产生ROS来稳定HIF-1α以促进血管生成

先前有研究发现，用LPS处理BMDM时，线粒体膜电位（MMP）增加，MRC的功能从产生ATP转向琥珀酸氧化，两者提供了反向电子传递的驱动力，琥珀酸氧化导致ROS产生从而促进HIF-1α的稳定和Il1b的表达。

作者首先利用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）染色和流式检测分析了WT和Dars2 MKO 小鼠的BMDM的MMP，发现空白处理时，WT和Dars2 KO BMDM的MMP相似，但是LPS刺激时，WT和Dars2 MKO MΦ中MMP增加程度也相当，表明Dars2 MKO 不影响BMDM MMP变化。

接下来，作者用MitoSOX染色评估细胞mtROS的产生，LPS刺激后，WT BMDM 中MitoSOX+细胞比例比空白对照增加了约2.6倍，而Dars2 KO BMDM中MitoSOX+细胞比例显著低于WT BMDM。检测过氧化物清除基因发现，在体外Dars2 KO BMDM（LPS+IFN-g）中和体内Dars2 MKO小鼠早期伤口MΦ中，Gclc、Gclm、Gsr和Sod2的表达显著降低。这表明，Dars2敲除不影响BMDM中线粒体MMP但是显著降低了线粒体产生mtROS的能力。

那么mtROS产生能力的降低是MRC损伤引起的吗？对HIF-1α又有什么影响？非变性凝胶电泳显示，与WT BMDM相比，Dars2缺陷BMDM中CI、CIII和CIV严重受损，在LPS+琥珀酸处理时HIF-1α依然发生降解。这表明，Dars2 KO MΦ中的MRC功能受损导致mtROS产生能力降低，进一步导致HIF-1α稳定性降低，导致早期伤口MΦ促炎症和促血管生成功能的减弱，进而影响早期的损伤修复。

早期MΦ产生mtROS的细胞亚群

作者进一步分析了scRNA-seq数据中每个亚群的血管生成特征评分，发现MΦ的血管生成评分在4 天和14 天时显著增加；对单个亚群分析发现，不同亚群的血管生成评分存在异质性，第3亚群的血管生成评分最高。有趣的是，血管生成评分与OXPHOS评分呈负相关，这表明愈伤相关的MΦ血管生成并不依赖于OXPHOS。

接下来，作者分析了每个亚群中与mtROS产生、炎症和血管生成相关基因的表达情况。在4天时，Il1b、Vegfa、Hif1a、Ldha和Slc2a1基因以及ROS清除基因Gclc、Gclm、Gsr、Sod2和Nfe2l2主要富集在0、2、3和5亚群中。值得注意的是，第3个亚群中Idh1下调、而Acod1上调，这是M1样MΦ的特征并且反映了第3个亚群中TCA循环的下调。综上所述，第3个亚群可能是愈伤早期MΦ重编程线粒体代谢产生mtROS的细胞类型。

IL-4Ra诱导的线粒体生物发生和OXPHOS在2型MΦ活化中起重要作用

那么在创伤修复晚期MRC有怎样的功能呢？作者发现，Dars2 MKO小鼠的晚期MΦ中MRC蛋白水平与早期MΦ没有差异，但是晚期MΦ却确实呈现 2型功能。与此同时，体外IL-4诱导M2型极化实验中，Dars2缺陷BMDM的M2极化受损。这些结果提示，在体内，损伤修复后期Dars2 KO MΦ中可能存在MRC的代偿机制。

作者进一步利用IL4在体诱导M2极化动物模型探索MRC功能及代偿机制。IL-4c可诱导局部MΦ增殖和M2型激活，作者通过小鼠腹腔注射IL-4c刺激构建2型免疫刺激模型，发现WT小鼠中IL-4c处理导致MΦ数量增加，而Dars2 MKO小鼠MΦ数量增加弱于WT小鼠。流式分选腹膜MΦ做免疫印迹分析显示，生理盐水处理的Dars 2 MKO小鼠的NDUFB8、UQCRC2、COX1蛋白水平比WT小鼠低，而IL-4c处理的Dars 2 MKO小鼠的OXPHOS亚基的蛋白水平比生理盐水处理组显著升高，并且IL-4c处理的WT小鼠和Dars2 MKO小鼠有相似的Retnla、Arg1和Chil3表达。这些结果表明，在Dars2 MKO小鼠的MΦ中M2型信号可能是通过IL-4-OXPHOS途径激活了线粒体代偿功能。

为了证实在晚期伤口MΦ中OXPHOS受到IL-4信号调控，作者首先分析了IL-4+IL-13刺激的WT BMDM线粒体的量，与对照组相比，IL-4+IL-13刺激的BMDM中线粒体显著增加，这表明M2型信号诱导了线粒体生物发生。

接下来，作者使用MTG染色结合流式细胞术分析了髓系细胞IL-4ra缺陷的小鼠（IL4ra MKO）和WT小鼠损伤后14天时的MΦ，与WT相比，IL4ra MKO小鼠MΦ中线粒体显著降低，这表明晚期伤口MΦ的线粒体生物发生依赖于IL-4Ra信号。那么，IL-4ra KO对晚期损伤口MΦ线粒体呼吸作用有何影响呢？OCR显示，与WT相比IL-4ra MKO小鼠晚期伤口MΦ的基础呼吸、ATP周转和剩余呼吸能力显著降低；ECAR显示，从IL-4ra MKO小鼠的晚期伤口MΦ糖酵解率显著降低。这表明，在晚期伤口MΦ中IL-4Ra介导了M2型信号诱导线粒体生物发生和OXPHOS。

M2型信号通过抑制mitoISR参与Dars2 KO中 MRC功能损伤的代偿

前期有研究发现，在非免疫细胞中，Dars2 KO引起的MRC功能损伤会诱导代偿性应激反应，特别是线粒体综合应激反应（mitoISR），mitoISR的特征是ATF4介导的单碳和叶酸途径、丝氨酸和脯氨酸分解代谢上调。那么，Dars2 KO 的BMDM是否发生了mitoISR？

mitoISR参与M2型信号保护线粒体功能的代偿机制吗？作者发现，与WT相比，Dars2 KO BMDM的全细胞裂解液中MRC亚基NDUFB8、UQCRC2和COX1的蛋白水平较低。值得注意的是，虽然IL-4 + IL-13刺激对WT细胞中的MRC蛋白水平没有显著影响，但是Dars2 KO MΦ中IL-4 + IL-13刺激增强了MRC亚基NDUFB8、UQCRC2、COX1和ATP5A 的稳定性。这提示M2型信号增强了MRC亚基的稳定性。RNA-seq分析显示，与WT相比，Dars2 KO MΦ中驱动mitoISR的关键转录因子Atf4和Ddit3/Cho及其下游靶基因表达上调。IL-4+IL-13刺激消除了Ddit3/Chop的表达上调。这些结果表明，M2型信号可以减轻Dars2 KO对线粒体功能的负面影响。

鉴于Dars2 KO上调Ddit3/Chop的表达以及IL-4+IL-13下调Ddit3/Chop的表达，作者推测在伤口愈合的后期M2型信号可能减弱了mitoISR。qRT-PCR显示，在WT和Dars2 KO小鼠的损伤后14天的伤口MΦ中，mitoISR特征性转录因子Atf4和Ddit3/Chop表达水平相当。这表明，愈伤后期M2型信号通过抑制mitoISR保护线粒体。

总 结

伤口愈合是一个高度协调的过程，单核/巨噬细胞是该过程的重要参与者，在促炎阶段参与抗菌，在促修复阶段参与组织重构。免疫细胞的功能变化常常伴随着代谢重编程，然而巨噬细胞在愈伤过程中的代谢重编程机制一直有待阐明。本文发现早期伤口MΦ具有M1/糖酵解特征，晚期伤口MΦ有M2/OXPHOS特征。早期伤口MΦ中，细胞通过糖酵解和MRC产生mtROS稳定HIF-1α，促进促炎和促血管生成基因的表达；晚期伤口MΦ中，细胞受M2型信号通过IL-4ra-OXPHOS途径进行代谢重编程，促进MΦ修复功能。该发现揭示了愈伤过程中的巨噬细胞代谢重编的调节机制，提供了增强伤口MΦ的新靶点。

责编/Jane

原文链接：

***/10.1016/j.cmet.2021.10.004