特应性皮炎是一种慢性、复发性、炎症性皮肤疾病，以剧烈瘙痒和大面积湿疹样皮损为主要临床表现[1-2]。特应性皮炎影响全球15%～20%的儿童和10%的成年人，严重影响患者的生活质量并导致睡眠障碍、抑郁等精神负担[3]。目前，临床上治疗特应性皮炎的药物主要为糖皮质激素和免疫抑制剂，其疗效不佳或价格昂贵，或有长期使用可引发皮肤萎缩变薄、色素沉着、继发感染和药物依赖等不良反应[1, 4]。因此，寻找临床疗效确切，能有效降低复发率且毒副作用较小的治疗策略或者药物，是当下亟需解决的问题。
共轭亚油酸是一种天然的具有共轭双键的十八碳二烯酸异构体的新型功能性脂肪酸，是人和动物不可或缺的脂肪酸之一。人体不能自主合成共轭亚油酸，主要通过摄入反刍动物产品如牛奶、奶酪及肉获得。共轭亚油酸有抗肿瘤、抗氧化、防治心脑血管疾病等多种重要生理功能，在药品、保健食品、功能食品以及食品添加剂中得到广泛应用[5-7]。
近年来的文献证实，共轭亚油酸具有免疫调节和抗炎作用，对于治疗炎症性疾病，如炎症性肠病、呼吸道炎症和动脉粥样硬化等均有良好的效果[8]。据此，本研究采用网络药理学结合动物实验考察共轭亚油酸对2, 4-二硝基氟苯（DNFB）诱导特应性皮炎模型小鼠的改善作用及可能作用机制，进一步拓展共轭亚油酸的临床应用，有望为特应性皮炎皮肤疾病的临床治疗与预防提供新策略。
共轭亚油酸与特应性皮炎的交集靶点
分别利用Swiss Target Prediction，STITCH 2个数据库搜寻共轭亚油酸对应的靶点基因，物种为Homo species，删除重复靶点，最终获取共轭亚油酸目标靶点108个。以“atopic dermatitis”为检索词，从DisGeNET 数据库中获得751个潜在靶点基因；GeneCard数据库中获得1 419个潜在靶点基因；TTD数据库共获得 52个靶点基因，删除重复靶点，确定最终靶点1 708个。利用Venn在线工具获得共轭亚油酸靶点与特应性皮炎靶点的交集靶点，共得到交集靶点48个，将获得的共轭亚油酸和特应性皮炎的交集靶点导入STRING数据库，限定物种为“Homo sapiens”，获取了PPI网络关系，如图1所示。
共轭亚油酸治疗特应性皮炎的关键靶点
利用STRING数据库及Cytoscape 3.9.0软件构建交集靶点的拓扑网络图，并对其进行网络拓扑参数分析，筛选出共轭亚油酸抗特应性皮炎的核心靶点。拓扑图共包括48个节点，182条边，degree值为7.58。根据节点的degree绘制出前10个关键节点图（图2），排名前10的关键靶点基因分别为TNF、PTGS2、LEP、PPARG、ADIPOQ、TP53、NR0B2、CYP19A1、ICAM1、NR3C1，见表1。
交集靶点的GO与KEGG通路分析
GO分析结果显示，生物过程（BP）主要涉及脂质代谢过程、对刺激物应激等；细胞组分（CC）主要与质膜、细胞膜、细胞质等有关；分子功能（MF）主要与脂质结合、信号传导过程、蛋白结合、转录因子结合等有关。
KEGG富集分析共获取17条显著性富集结果，与特应性皮炎密切相关的通路包含PPAR信号通路、花生四烯酸代谢、cAMP信号通路、AMPK信号通路等。在所有信号通路中PPAR信号通路涉及的靶标最多，且特应性皮炎P值最小，与特应性皮炎相关性最高。富集在PPAR信号通路的靶点分别为NR1H3、PPARD、PPARG、FABP5、ADIPOQ、PPARA，其中PPARG和ADIPOQ为关键靶点基因，见图3。
共轭亚油酸对特应性皮炎小鼠皮损的影响
由图4A表明，与对照组相比，局部使用DNFB进行激发致敏，模型组小鼠皮损加重，背部皮肤可见红斑、水肿、糜烂、脱屑结痂等改变，提示造模成功。与模型组相比，共轭亚油酸小鼠皮损处的点状出血，红斑、干燥及结痂等症状明显减轻。图4B表明，模型组小鼠皮损评分呈时间相关性显著性升高（P＜0.01）。相对于模型组，共轭亚油酸组小鼠皮损评分明显下降（P＜0.05）。
共轭亚油酸对特应性皮炎小鼠皮损组织病理学的影响
HE切片病理染色和TB染色发现，与对照组相比，模型组小鼠皮肤中棘层细胞层数显著增加，且真皮层炎性细胞浸润、毛细血管增生、扩张充血等现象明显，小鼠皮损中肥大细胞浸润明显。而共轭亚油酸组上述病理变化显著改善，见图5。
与对照组相比，模型组小鼠皮肤表皮明显增厚，肥大细胞数量显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，共轭亚油酸组表皮厚度显著降低（P＜0.05），肥大细胞数量显著下降（P＜0.05、0.01），见图6。
共轭亚油酸对特应性皮炎小鼠IgE、IL-4、IFN-γ水平的影响
如图7所示，与对照组相比，模型组小鼠血清中IgE、IL-4、IFN-γ水平均显著提高（P＜0.05、0.01）；与模型组相比，共轭亚油酸组血清IgE、IL-4、IFN-γ水平明显降低（P＜0.05、0.01）。
共轭亚油酸对特应性皮炎小鼠皮损处PPARG蛋白的影响
如图8所示，对照组小鼠皮肤中PPARG蛋白呈阳性表达，表皮层以及真皮层均可见较深色棕黄色颗粒。与对照组比较，模型组中PPARG蛋白的表达明显呈现出弱阳性特征，而共轭亚油酸组PPARG蛋白的表达有所恢复。
讨论
特应性皮炎是皮肤科一种常见的炎症性皮肤病，其临床特点是Th1/Th2失衡、IgE超敏反应、瘙痒及湿疹性皮肤病变，全球发病率不断上升[12]。肥大细胞是介导过敏性炎症反应发生的主要起始细胞之一[13-14]。血清中IgE水平显著升高且Th1/Th2细胞免疫反应失衡是特应性皮炎患者重要的免疫学特点[15-16]。目前在临床上，特应性皮炎尚缺乏安全有效的治疗药物。共轭亚油酸是亚油酸的一类同分异构体，常以c9t11和t10c12–共轭亚油酸异构体形式存在，也是多种共轭亚油酸异构体中具有生理活性的成分[7, 17]。Whigham等[18]证明共轭亚油酸能够减少抗原诱导的组胺和PGE2释放，提示共轭亚油酸对特应性皮炎的潜在治疗作用。
本研究运用网络药理学的方法探讨共轭亚油酸抗特应性皮炎的可能作用机制和关键靶点，并通过体内实验进一步验证共轭亚油酸对DNFB诱导的特应性皮炎小鼠皮损的改善作用及核心基因表达的改变。通过网络药理学分析显示，共轭亚油酸与特应性皮炎共有48个交集靶基因，基于STRING交互作用网络数据库构建交集靶点的PPI网络，并利用Cytoscape软件中CytoHubba插件对网络拓扑异构分析，发现TNF、PTGS2、LEP、PPARG、ADIPOQ、TP53、NR0B2、CYP19A1、ICAM1、NR3C1是排名前10的关键基因，可能在共轭亚油酸减轻特应性皮炎皮肤炎症中发挥重要作用。为了探讨共轭亚油酸抗特应性皮炎的潜在关键通路，我们对交集靶点进行KEGG通路分析，共筛选出17条显著性富集通路，其中PPAR信号通路最为显著，且以富集在通路上的靶点PPARG与ADIPOQ为枢纽基因。
越来越多的证据表明，PPAR信号通路是各种皮肤病的新兴的治疗靶点，包括炎症性皮肤病，如牛皮癣、特应性皮炎以及皮肤恶性肿瘤等[19-20]。PPAR是调节脂质、葡萄糖、氨基酸代谢的核受体超家族的成员，隶属于核激素受体，由3种不同的亚型组成，即PPARα、PPARγ（PPARG）和PPARβ/δ[21]。研究发现，PPAR与特定配体结合后，参与调节了多种皮肤功能，包括角质形成细胞增殖、表皮屏障形成、伤口愈合、黑素细胞增殖和皮脂产生，提示其可作为治疗炎症性皮肤疾病的潜在靶标[22]。
在炎症性皮肤病中，包括过度增殖性银屑病表皮以及特应性皮炎患者皮损皮肤中，PPARα和PPARγ的表达都降低[23-25]。这一观察结果表明，PPARα和PPARγ激活剂或正向调节PPAR基因表达的化合物可能代表一类新型非甾体类消炎药，用于局部或全身治疗常见的炎症性皮肤病，如特应性皮炎，牛皮癣和过敏性接触性皮炎等。据报道，PPAR的活化可降低Th2免疫反应水平[26]，并且高表达的PPARG通过抑制NF-κB的活性来抑制IL-6、TNF-α的形成，进而抑制过激的炎症反应[27]。
另外，KEGG结果还筛选出富集在该通路上另一个枢纽靶点ADIPOQ。ADIPOQ是由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，可通过与靶细胞膜上的脂联素受体结合发挥抗炎、胰岛素增敏、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化等药理作用[28-29]。最新研究发现，特应性皮炎患者（尤其是外源性特应性皮炎患者）的血清和皮肤组织中ADIPOQ的水平显著低于正常对照者，并且与总IgE水平呈负相关[30-31]。另外，SEO等[32]也发现特应性皮炎患者表皮中脂联素受体的表达减少，并在体外通过特应性皮炎样3D皮肤等效模型证实了ADIPOQ可通过抑制角质形成细胞中炎症介质的表达，增强脂质合成以及表皮分化的能力，进而修复受损的皮肤屏障功能。
体内动物实验结果表明，共轭亚油酸明显改善DNFB诱导的特应性皮炎小鼠湿疹样皮损，具体表现为皮损严重程度减轻、炎性细胞与肥大细胞浸润减少以及Th1/Th2型细胞因子水平下降。另外，本研究也发现共轭亚油酸可显著性上调特应性皮炎小鼠皮损中PPAR信号通路上关键基因PPARG的表达，提示PPARG是共轭亚油酸治疗特应性皮炎的潜在靶点。
综上，本研究为深入探讨共轭亚油酸抗特应性皮炎的作用机制提供新思路和新方法，也为共轭亚油酸治疗特应性皮炎潜在机制提供部分参考。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：汤柳，李小磊，曹晓琴，周本宏，宋伟．基于网络药理学分析及实验验证探讨共轭亚油酸治疗特应性皮炎的作用机制 [J]. 现代药物与临床, 2022, 37(10): 2206-2214 .
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